大鼠4-羥基雌二醇(4-OH-E2)酶聯(lián)免疫分析

試劑盒使用說明書

本試劑盒僅供研究使用。

檢測范圍：96T

6ng/L-250ng/L

使用目的：

本試劑盒用于測定大鼠血清，血漿及相關(guān)液體樣本 4-羥基雌二醇(4-OH-E2)含量。

實驗原理

本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中大鼠 4-羥基雌二醇(4-OH-E2)水平。用純化的大鼠 4-羥基雌二醇(4-OH-E2)抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入4-羥基雌二醇(4-OH-E2)，再與 HRP 標(biāo)記的 4-羥基雌二醇(4-OH-E2)抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過洗滌后加底物 TMB 顯色。TMB 在 HRP 酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的黃色。顏色的深淺和樣品中的 4-羥基雌二醇(4-OH-E2) 呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在 450nm 波長下測定吸光度（OD 值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中大鼠 4-羥基雌二醇(4-OH-E2)濃度。

試劑盒組成

1	30 倍濃縮洗滌液	20ml×1 瓶	7	終止液	6ml×1 瓶
2	酶標(biāo)試劑	6ml×1 瓶	8	標(biāo)準(zhǔn)品（400ng/L）	0.5ml×1 瓶
3	酶標(biāo)包被板	12 孔×8 條	9	標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液	1.5ml×1 瓶
4	樣品稀釋液	6ml×1 瓶	10	說明書	1 份
5	顯色劑 A 液	6ml×1 瓶	11	封板膜	2 張
6	顯色劑 B 液	6ml×1/瓶	12	密封袋	1 個

標(biāo)本要求

1. 標(biāo)本采集后盡早進行提取，提取按相關(guān)文獻進行，提取后應(yīng)盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融

2. 不能檢測含 NaN3 的樣品，因 NaN3 抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

操作步驟

1. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：本試劑盒提供原倍標(biāo)準(zhǔn)品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀釋。

200ng/L	5 號標(biāo)準(zhǔn)品	150μl 的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入 150μl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
100ng/L	4 號標(biāo)準(zhǔn)品	150μl 的 5 號標(biāo)準(zhǔn)品加入 150μl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
50ng/L	3 號標(biāo)準(zhǔn)品	150μl 的 4 號標(biāo)準(zhǔn)品加入 150μl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
25ng/L	2 號標(biāo)準(zhǔn)品	150μl 的 3 號標(biāo)準(zhǔn)品加入 150μl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
12.5ng/L	1 號標(biāo)準(zhǔn)品	150μl 的 2 號標(biāo)準(zhǔn)品加入 150μl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

2. 加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣 50μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品 10μl（樣品終稀釋度為 5 倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。

3. 溫育：用封板膜封板后置 37℃溫育 30 分鐘。

4. 配液：將 30 倍濃縮洗滌液用蒸餾水 30 倍稀釋后備用

5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置 30 后棄去，如此重復(fù) 5 次，拍干。

6. 加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑 50μl，空白孔除外。

7. 溫育：操作同 3。

8. 洗滌：操作同 5。

9. 顯色：每孔先加入顯色劑 A50μl，再加入顯色劑 B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色

10 分鐘.

10. 終止：每孔加終止液 50μl，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。

11. 測定：以空白空調(diào)零，450nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD 值）。測定應(yīng)在加終止液后 15 分鐘以內(nèi)進行。

操作程序總結(jié)：

計算

以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD 值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD 值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與 OD 值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的 OD 值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。