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本生資訊| ELISA試劑盒實驗常見問題及解決方法

　　對于ELISA試劑盒實驗新手來說，實驗中遇到的一些棘手的問題便無從下手，天津本生小編列出了ELISA試劑盒實驗中一些常見的問題以及解決方法，希望對您有所幫助：

　　問題序號可能原因解決方法顯色淡，靈敏度偏低

　　1 試劑盒未充分平衡試劑盒從2～8℃冰箱取出后打開盒蓋，于室溫平衡至少20分鐘，確保所有試劑已平衡至室溫(約25℃)

　　2 樣品不適合做ELISA檢測樣品一般選擇培養(yǎng)上清、血清、血漿。其他樣品形式可能不適合做ELISA檢測或者需要優(yōu)化檢測的條件(例如稀釋液的成分)

　　3 酶標(biāo)板在貯存或洗后拍干時過分干燥防止板過于干燥

　　4 包被抗體遭到破壞操作溫和，移液槍不能碰到孔底

　　5 樣本和抗體孵育條件不合適按照說明書條件，建議孵育過程中全程振蕩孵育。

　　6 洗滌浸泡時間過長按照說明書操作。勿人為增加浸泡時間;

　　7 偶聯(lián)HRP試劑污染棄去試劑，重新配置

　　8 錯誤的稀釋偶聯(lián)HRP試劑棄去試劑，重新配置

　　9 TMB底物孵育時間過短，因非人為因素影響，需要優(yōu)化孵育時間確定合適的孵育時間：人為判定-濃度的標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)深藍(lán)色;S4-5有淡藍(lán)色;機器判定620 nm波長下測定OD值達(dá)到0.6-0.65

　　10 樣本濃度過高或存在基質(zhì)效應(yīng)建議做不同稀釋倍數(shù)，確認(rèn)樣本合適的稀釋倍數(shù)。

　　11 酶標(biāo)儀濾光片設(shè)置有問題或者波長選擇不對確認(rèn)儀器設(shè)置及選擇正確的波長檢測。

　　12 酶標(biāo)板不適合做ELISA不能使用細(xì)胞培養(yǎng)板，建議使用ELISA用高吸附力板子。

　　背景深，全部呈有色(通常的Elisa背景值OD<0.2)

　　1 洗滌不充分，洗后未拍干，樣品中其它成分殘留或酶標(biāo)記物殘留洗液準(zhǔn)確配制;充分洗滌，靜置15，拍干。加樣或加酶拍板的濾紙應(yīng)棄去不用，不要反復(fù)使用，否則易造成污染。

　　2 底物污染，未避光保存，出現(xiàn)顏色棄去底物，重新配置

　　3 樣品稀釋液污染棄去稀釋液，重新配置

　　4 吸頭重復(fù)使用，未洗凈或消毒不吸頭盡可能一次性使用

　　5 不正確的孵育時間，溫度(尤其是底物孵育的時間)為常用的溫育溫度有37℃和室溫，其次是43℃和2～8℃。按照說明書要求。

　　6 偶聯(lián)抗體(streptavidin-HRP)濃度過高按照說明書調(diào)整到合適的濃度

　　7 ELISA板子不正確的貯存酶標(biāo)板貯存于2-8 ℃;使用結(jié)合力低點的Elisa板8 沒有正確封閉在標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液中加入動物蛋白或延長封閉時間

　　9 樣本溶血嚴(yán)重建議使用非溶血或輕微溶血樣本，嚴(yán)重溶血樣本會導(dǎo)致背景偏高。

　　重復(fù)性不佳，高CV值

　　1 樣品不均一加樣充分混勻樣品，取樣確保移液位置一致;

　　2 包被板表面遭到破壞洗板加樣時盡量小心，避免破壞板的包被表面

　　3 孔與孔之間的交叉污染孵育后取下蓋子小心操作，避免孔與孔的污染;封板膜不能重復(fù)使用

　　4 加樣量不一致樣品稀釋應(yīng)充分混勻，盡可能使用同一移液器并裝緊吸嘴

　　5 邊緣效應(yīng)(外周孔顯色較中心孔深)孵育時盡量100 rpm旋轉(zhuǎn)混勻

　　6 微量加樣不準(zhǔn)確微量加樣的準(zhǔn)確性和均一性

　　7 不正確的洗滌洗液準(zhǔn)確配制;充分洗滌，靜置15，確定每一步的洗滌出現(xiàn)白板

　　陽性對照不顯色

　　1 顯色液變質(zhì)更換新的顯色液

　　2 洗滌液配制有誤請按說明書所示稀釋倍數(shù)配制3 未加酶結(jié)合物而認(rèn)為已加入注意不要漏加

　　4 終止液誤作洗滌液稀釋或當(dāng)?shù)孜镆菏褂妹看渭右壕鶓?yīng)看清標(biāo)簽

　　5 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋方法錯誤/或標(biāo)準(zhǔn)品有問題請按照說明書所示配置說明書，注意單位和稀釋倍數(shù)

　　6 不同試劑盒或不同批號的試劑混用建議使用同批次試劑盒。不能混用不同試劑盒或不同批號的試劑。

　　不正常的標(biāo)準(zhǔn)曲線

　　1 錯誤的方法重懸標(biāo)準(zhǔn)品 加入正確量的溶液重懸標(biāo)準(zhǔn)品，重懸充分

　　2 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋錯誤 按照說明書要求稀釋標(biāo)準(zhǔn)品

　　3 標(biāo)準(zhǔn)品污染 使用一次性的滅菌吸頭，標(biāo)準(zhǔn)品貯存于2-8 ℃

　　4 錯誤的倍比稀釋步驟 按照說明書倍比稀釋標(biāo)準(zhǔn)品

　　5 波長選擇錯誤TMB為底物和以O(shè)PD為底物的試劑盒均有使用，而 者比色波長為450nm，后者為492nm。雙波長比色分析優(yōu)于單波長。

　　6 標(biāo)準(zhǔn)品混用 不同批號試劑勿混用

　　7 試劑盒在運輸途中時間太長，溫度太高，標(biāo)準(zhǔn)品失活 盡量縮短運輸時間，夏季應(yīng)放冰塊降溫

　　8 ELISA未終止而直接檢測450nm和620nmTMB顯色需終止后檢測，否則會出現(xiàn)620nm比450nm讀數(shù)高的現(xiàn)象。

　　(數(shù)值仍有梯度規(guī)律)樣品或標(biāo)準(zhǔn)品OD超出正常范圍

　　1 錯誤的樣品或標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋 按照說明書稀釋2 偶聯(lián)抗體濃度過高 按照說明書調(diào)整到合適的濃度3 TMB底物孵育時間過長 調(diào)整到合適的孵育時間4 樣品或標(biāo)準(zhǔn)品污染 避免污染5 錯誤的孵育時間或溫度 按照說明書6 孵育時未加蓋導(dǎo)致溶液揮發(fā)和污染 貼封片或加蓋標(biāo)曲很好，但是樣本無法計算到數(shù)值1 標(biāo)曲選擇不合適選擇合適的標(biāo)曲擬合;

　　2 樣本含量很低，低于靈敏度無法被檢測到嘗試濃縮樣本或使用高敏ELISA試劑盒檢測3樣本含量很高，超過標(biāo)曲建議進(jìn)行預(yù)實驗摸索稀釋倍數(shù)，確保樣本OD值落在標(biāo)曲范圍內(nèi)標(biāo)曲高濃度間無明顯趨勢1如OD絕對值靠譜，但是僅無梯度，則顯色過度TMB顯色體系中建議根據(jù)S1，S2顏色進(jìn)行判斷，當(dāng)S1，S2深藍(lán)色，有明顯梯度，S5有淡藍(lán)色時即可終止。2僅作單波長檢測。由于參考波長讀取非特異性檢測，如指紋、劃痕、水漬等，對結(jié)果也有影響。建議終結(jié)果以雙波長為準(zhǔn)確。兔ELISA試劑盒

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原創(chuàng)作者：本生（天津）健康科技有限公司