人血清素/血清胺（ST）酶聯(lián)免疫分析試劑盒技術文獻說明_技術文章

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人血清素/血清胺（ST）酶聯(lián)免疫分析試劑盒技術文獻說明
閱讀次數(shù)：15634 發(fā)布時間：2020/12/23 13:41:37

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人血清素/血清胺（ST）酶聯(lián)免疫分析試劑盒技術文獻說明

本試劑盒僅供研究使用

實驗原理

用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗ST 抗體的微孔中依次加入標本或標準品、生物素化的抗ST 抗體、HRP 標記的親和素，經(jīng)過徹底洗滌后用底物TMB 顯色。TMB 在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的ST 呈正相關。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度(OD 值)，計算樣品濃度。

特異性：本試劑盒可同時檢測天然或重組的人血清素/血清胺(ST)，且與其他相關蛋白無交叉反應。

有效期：6 個月

預期應用：ELISA 法定量測定人血清、血漿、細胞培養(yǎng)上清或其它相關生物液體中血清素/血清胺(ST)含量。說明

1.試劑盒保存：-20℃(較長時間不用時);2-8℃(頻繁使用時)。

2.濃洗滌液低溫保存會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。

3.中、英文說明書可能會有不致之處，請以英文說明書為準。

4.剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質，此為正�，F(xiàn)象，不會對實驗結果造成任何影響。

人血清素/血清胺(ST)elisa試劑盒試劑盒組成及試劑配制

1. 酶聯(lián)板(Assay plate )：塊(96 孔)。

2. 標準品(Standard)：2 瓶(凍干品)。

3. 樣品稀釋液(Sample Diluent)：1×20ml/瓶。

4. 生物素標記抗體稀釋液(Biotin-antibody Diluent)：1×10ml/瓶。

5. 辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液(HRP-avidin Diluent)：1×10ml/瓶。

6. 生物素標記抗體(Biotin-antibody)：1×120μl/瓶(1：100)

7. 辣根過氧化物酶標記親和素(HRP-avidin)：1×120μl/瓶(1：100)

8. 底物溶液(TMB Substrate)：1×10ml/瓶。

9. 濃洗滌液(Wash Buffer)：1×20ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25 倍。

10. 終止液(S Solution)：1×10ml/瓶(2N H2SO4)。

需要而未提供的試劑和器材

1. 標準規(guī)格酶標儀

2. 高速離心機

3. 電熱恒溫培養(yǎng)箱

4. 干凈的試管和Eppendof 管

5. 系列可調節(jié)移液器及吸頭，次檢測樣品較多時，用多通道移液器

6. 蒸餾水，容量瓶等標本的采集及保存

1. 血清：全血標本請于室溫放置2 小時或4℃過夜后于1000 x g 離心20 分鐘，取上清即可檢測，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。

2. 血漿：可用EDTA 或肝素作為抗凝劑，標本采集后30 分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g 離心15 分鐘，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。

3. 細胞培養(yǎng)物上清或其它生物標本：1000 x g 離心20 分鐘，取上清即可檢測，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。

注：標本溶血會影響zui后檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。

人血清素/血清胺（ST）酶聯(lián)免疫分析試劑盒技術文獻說明

標本的稀釋原則：

先通過文獻檢索的方式了解待測樣本的大致含量，確定適當?shù)南♂尡稊?shù)。只有稀釋至標準曲線的范圍內(nèi)，檢測的結果才是準確的。稀釋的過程中，應做好詳細的記錄。zui后計算濃度時，稀釋了“N”倍，標本的濃度應再乘以“N”。

標準品的稀釋原則：2 瓶，每瓶臨用以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10 分鐘以上，然后反復顛倒/搓動以助溶解，其濃度為200 ng/ml，做系列倍比稀釋后，分別稀釋200 ng/ml，100 ng/ml，50 ng/ml，25 ng/ml，12.5 ng/ml，6.25 ng/ml，3.12 ng/ml，樣品稀釋液直接作為標準濃度0 ng/ml，臨用15 分鐘內(nèi)配制。如配制100 ng/ml 標準品：取0.5ml(不要少于0.5ml)200 ng/ml 的上述標準品加入含0.5ml 樣品稀釋液的Eppendorf 管中，混勻即可，其余濃度以此類推。

生物素標記抗體的稀釋原則：

臨用以生物素標記抗體稀釋液稀釋，稀釋根據(jù)預先計算好的每次實驗所需的總量配制(每孔100μl) ，實際配制時應多配制0.1-0.2ml。如10μl 生物素標記抗體加990μl 生物素標記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用小時內(nèi)配制。

辣根過氧化物酶標記親和素的稀釋原則：

臨用以辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液稀釋，稀釋根據(jù)預先計算好的每次實驗所需的總量配制(每孔100μl)，實際配制時應多配制0.1-0.2ml。如10μl 辣根過氧化物酶標記親和素加990μl 辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用小時內(nèi)配制。

人血清素/血清胺(ST)elisa試劑盒操作步驟

實驗開始，請?zhí)崤渲煤盟性噭噭┗驑悠废♂寱r，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。每次檢測都應該做標準曲線。如樣品濃度高時，用樣品稀釋液進行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。

1. 加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔�？瞻卓准訕悠废♂屢�100μl，余孔分別加標準品或待測樣品

100μl，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜，37℃反應120 分鐘。為保證實驗結果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。

2. 棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加生物素標記抗體工作液100μl(取1μl 生物素標記抗體加99μl 生物素標記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用小時內(nèi)配制)，37℃,60 分鐘。

3. 溫育60 分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3 次，每次浸泡1-2 分鐘，350μl/每孔，甩干。

4. 每孔加辣根過氧化物酶標記親和素工作液(同生物素標記抗體工作液) 100μl，37℃，60 分鐘。

5. 溫育60 分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5 次，每次浸泡1-2 分鐘，350μl/每孔，甩干。

6. 依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光顯色(30 分鐘內(nèi)，此時肉眼可見標準品的3-4 孔有明顯的梯度藍色，后3-4 孔梯度不明顯，即可終止)。

7. 依序每孔加終止溶液50μl，終止反應(此時藍色立轉黃色)。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結果的準確性，底物反應時間到后應盡快加入終止液。

8. 用酶聯(lián)儀在450nm 波長依序測量各孔的光密度(OD 值)。在加終止液后15 分鐘以內(nèi)進行檢測。

注：

1. 用戶在初次使用試劑盒時，應將各種試劑管離心數(shù)分鐘，以便試劑集中到管底。

2. 每次實驗留孔作為空白調零孔，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2N H2SO4。測量時先用此孔調OD 值至零。

3. 為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標板加上蓋或覆膜。

4. 未使用完的酶標板或者試劑，請于2-8℃保存。標準品、生物素標記抗體工作液、辣根過氧化物酶標記親和素工作液請依據(jù)所需的量配置使用。請勿重復使用已稀釋過的標準品、生物素標記抗體工作液或、辣根過氧化物酶標記親和素工作液。

5. 建議檢測樣品時均設雙孔測定，以保證檢測結果的準確性。

洗板方法

手工洗板方法：吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標板內(nèi)的液體;在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次;將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml 注入孔內(nèi)，浸泡1-2 分鐘。根據(jù)需要，重復此過程數(shù)次。自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。

計算

以標準物的濃度為橫坐標(對數(shù)坐標)，OD 值為縱坐標(普通坐標)，在半對數(shù)坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD 值由標準曲線查出相應的濃度;再乘以稀釋倍數(shù);或用標準物的濃度與OD 值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD 值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。

人血清素/血清胺（ST）酶聯(lián)免疫分析試劑盒技術文獻說明

注意事項

1. 當混合蛋白溶液時應盡量輕緩，避免起泡。

2. 洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。

3. 次加樣時間控制在5 分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。

4. 請每次測定的同時做標準曲線，做復孔。

5. 如標本中待測物質含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù)。

6. 在配制標準品、檢測溶液工作液時，請以相應的稀釋液配制，不能混淆。

7. 底物請避光保存。

8. 不要用其它生產(chǎn)廠家的試劑替換試劑盒中的試劑

原創(chuàng)作者：本生（天津）健康科技有限公司