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ELISA實(shí)驗(yàn):Elisa具體操作流程及注意事項(xiàng)2023動(dòng)態(tài)已更新
閱讀次數(shù):15328 發(fā)布時(shí)間:2023/6/14 11:12:15
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  ELISA實(shí)驗(yàn):Elisa具體操作流程及注意事項(xiàng)
 

  ELISA實(shí)驗(yàn)原理是酶分子與抗體或抗抗體分子共價(jià)結(jié)合,此種結(jié)合不會(huì)改變抗體的免疫學(xué)特性,也不影響酶的生物學(xué)活性。

  酶標(biāo)記抗體可與吸附在固相載體上的抗原或抗體發(fā)生特異性結(jié)合。滴加底物溶液后,底物可在酶作用下使其所含的供氫體由無(wú)色的還原型變成有色氧化型,出現(xiàn)顏色反應(yīng)。

elisa 試劑盒 本生 抗體 抗原

 

  因此,可通過(guò)底物的顏色反應(yīng)來(lái)判定有無(wú)相應(yīng)的免疫反應(yīng),顏色反應(yīng)的深淺與標(biāo)本中相應(yīng)抗體或抗原的量呈正比。此種顯色反應(yīng)可通過(guò)ELISA檢測(cè)儀進(jìn)行定量測(cè)定,這樣就將酶化學(xué)反應(yīng)的敏感性和抗原抗體反應(yīng)的特異性結(jié)合起來(lái),使ELISA方法成為一種既特異又敏感的檢測(cè)方法。

  ELISA實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng):

  1、固相載體選擇

  聚苯乙烯:具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能,抗體或抗原吸附其上后仍保留原來(lái)的免疫學(xué)活性。

  聚氯乙烯:聚氯乙烯對(duì)蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高,但空白值也略高。

  良好的ELISA板應(yīng)該是吸附性能好,空白值低,孔底透明度高,各板之間、同一板各孔之間性能相近。

  2、包被

 、侔蹇椎倪x擇:ELISA別的微孔板。

 、诳贵w選擇:選擇支持ELISA實(shí)驗(yàn)的抗體,根據(jù)推薦濃度稀釋或摸索適濃度。

 、郯痪彌_液:pH9.6碳酸鹽緩沖液或pH7.2磷酸鹽緩沖液。

 、馨粶囟龋2-8 ℃過(guò)夜包被或室溫(37℃)包被2h。

 、莅粷舛龋喊粷舛入S載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化。一般包被濃度為10ug/ml-20ug/ml。

  3、封閉

 、侔恢笠欢ㄒ⒓捶忾](封閉非特異性抗體)。

 、谶x擇效果較好的封閉劑(細(xì)胞培養(yǎng)BSA、Tween等)。

  4、加樣及孵育

  ①加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在ELISA板孔的底部,避免加在孔壁上部,并注意不可濺出,不可產(chǎn)生氣泡。

  ②孵育的時(shí)間及溫度參考試劑盒說(shuō)明書(shū)。如有條件,建議加樣孵育時(shí)使用shaker震蕩儀,推薦軌道直徑3mm,轉(zhuǎn)速在500±50rpm。

 、蹤z測(cè)抗體、酶標(biāo)物的稀釋比例、孵育溫度、孵育時(shí)間嚴(yán)格根據(jù)說(shuō)明書(shū)提示。

 、芟窗鍖(duì)于ELISA來(lái)說(shuō),是其關(guān)鍵的一步,ELISA的特異性。

 、莘獍迥ひ欢ㄒ淮我粨Q,切勿二次甚至多次使用,以防交叉污染。

  5、顯色和終止

 、偈褂眯铏z查,底物在加入96孔板之應(yīng)為無(wú)色透明。

 、陲@色底物需現(xiàn)配現(xiàn)用,避免污染。

 、鄯跤龝r(shí)間,說(shuō)明書(shū)上為參考范圍,具體需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件自行摸索?蓞⒖紭(biāo)曲濃度孔的顏色,變?yōu)樗{(lán)色較明顯時(shí)即可。

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