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　　ELISA直接法和間接法優(yōu)缺點(diǎn)及標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)
 

　　在ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，我們得到的是經(jīng)酶標(biāo)儀得出的標(biāo)準(zhǔn)品以及樣本的OD值。其中，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度已知，我們可以利用標(biāo)準(zhǔn)品的OD值及其相對(duì)應(yīng)的濃度，以O(shè)D值為橫坐標(biāo)，濃度為縱坐標(biāo)，做一條標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，并用公式表示出來(lái)。這樣，我們把樣本的OD值以X值代入，便可求出Y值，即樣本濃度。

　　直接法(direct ELISA)

　　將抗原直接固定在固相載體上，加入酶標(biāo)記的一抗體，即可測(cè)定抗原總量，此一抗體的特異性非常重要。

　　優(yōu)勢(shì)：操作手續(xù)簡(jiǎn)短，因無(wú)須使用二抗可避免交互反應(yīng)。

　　缺點(diǎn)：試驗(yàn)中的一抗都得用酶標(biāo)記，但不是每種抗體都適合做標(biāo)記，費(fèi)用相對(duì)提高。

　　間接法(indirect ELISA)

　　此測(cè)定方法與直接法類(lèi)似，差別在于一抗體沒(méi)有酶標(biāo)記，改用酶標(biāo)記的二抗體去辨識(shí)一抗體來(lái)測(cè)定抗原量。

　　優(yōu)勢(shì)：二抗可以加強(qiáng)信號(hào)，而且有多種選擇能做不同的測(cè)定分析。不加酶標(biāo)記的一抗體則能保留它多的免疫反應(yīng)性。

　　缺點(diǎn)：交互反應(yīng)發(fā)生的機(jī)率較高。
 

　　BUNSEN本生詳解：一步步來(lái)實(shí)現(xiàn)這個(gè)目標(biāo)：

　　1.先，將數(shù)據(jù)整理好輸入Excel，分別為經(jīng)酶標(biāo)儀讀出標(biāo)準(zhǔn)品的OD值及其對(duì)應(yīng)的濃度值。

　　2.拖動(dòng)鼠標(biāo)選取完成的數(shù)據(jù)區(qū)，并點(diǎn)擊圖表向?qū)�，在圖表類(lèi)型中選“XY散點(diǎn)圖”，并選擇子圖表類(lèi)型的“散點(diǎn)圖”(個(gè)沒(méi)有連線(xiàn)的)，如下圖所示。

　　3.點(diǎn)擊“下一步”，出現(xiàn)如下圖界面。如是輸入是如本例橫向列表的就不用更改，如果是縱向列表就改選“列”。

　　4.在做ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，并通過(guò)此曲線(xiàn)求樣本濃度時(shí)，因樣本OD值是已知的，因此我們需要將OD值設(shè)為X。根據(jù)上圖我們可以看到，橫坐標(biāo)X值為OD值，縱坐標(biāo)Y為標(biāo)準(zhǔn)品濃度，這正是我們想要的。

　　有時(shí)需要我們手動(dòng)選擇X值，這時(shí)可以點(diǎn)擊“系列”來(lái)更改，如下圖。

　　如果要對(duì)橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)進(jìn)行調(diào)換，我們可以就點(diǎn)擊X值和Y值文本框右邊的小圖標(biāo)，結(jié)果如下圖：

　　出現(xiàn)上圖后，拖動(dòng)鼠標(biāo)選取正確的數(shù)據(jù)區(qū)域以調(diào)整X或Y。

　　5.調(diào)好之后，然后點(diǎn)擊“下一步”出現(xiàn)圖標(biāo)選項(xiàng)界面，如下圖。

　　6.點(diǎn)擊“下一步”，在彈出的窗口再點(diǎn)擊“完成”，現(xiàn)在一張帶標(biāo)準(zhǔn)值的完整散點(diǎn)圖就已經(jīng)完成，如下圖。

　　7.到了這一步，散點(diǎn)圖便完成了。曲線(xiàn)在哪里?

　　其實(shí)很簡(jiǎn)單，先點(diǎn)擊圖上的標(biāo)準(zhǔn)值點(diǎn)(記住一定要點(diǎn)選上)，然后單擊右鍵，點(diǎn)擊“添加趨勢(shì)線(xiàn)”。彈出趨勢(shì)線(xiàn)類(lèi)型選擇對(duì)話(huà)框，有線(xiàn)性，對(duì)數(shù)，多項(xiàng)等選項(xiàng)，如下圖：

　　8.在選擇之，我們先對(duì)上圖做一下肉眼觀察，如果那些點(diǎn)能連成一條直線(xiàn)，或接近直線(xiàn)，我們就選擇“線(xiàn)性”，意思就是出來(lái)的趨勢(shì)線(xiàn)是一條直線(xiàn)，相應(yīng)的該直線(xiàn)的方程就是y=ax+b的形式。不過(guò)一般的ELISA都不會(huì)是所有的標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)呈的線(xiàn)性關(guān)系的，也就是說(shuō)不是一條的直線(xiàn)，這時(shí)我們可以選擇“多項(xiàng)式”，多項(xiàng)式后面還有“階數(shù)”的選擇，也就是說(shuō)求出來(lái)的方程是幾次方，我們一般選“2階”，即出來(lái)的方程為y=ax2+bx+c. 選擇完畢后，彈出以下窗口。

　　9.趨勢(shì)線(xiàn)也就是標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)在此便顯示出來(lái)了。接下來(lái)我們需要將公式顯示出來(lái)，以根據(jù)樣本的OD值計(jì)算其濃度值。在鼠標(biāo)點(diǎn)選該線(xiàn)(一定要選中，選中后出現(xiàn)下圖的樣子即線(xiàn)由很多店標(biāo)識(shí)出來(lái))，單擊鼠標(biāo)右鍵，選擇趨勢(shì)線(xiàn)格式。我們?cè)趶棾龅拇翱谥羞x擇“選項(xiàng)”選項(xiàng)卡，出現(xiàn)下圖，我們選擇顯示公式，顯示R方，即相關(guān)系數(shù)，這時(shí)公式與R方值便都顯示出來(lái)了。

　　我們將樣本的OD值作為X代入上述方程，求出來(lái)的便為濃度值了。

　　一般ELISA的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的相關(guān)系數(shù)要達(dá)到0.99以上，本例中為0.9999，非常不錯(cuò)的曲線(xiàn)，這樣就了由該曲線(xiàn)及其方程求出的樣本濃度具有很強(qiáng)的可信性。

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原創(chuàng)作者：本生（天津）健康科技有限公司