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　　輔酶ⅠNAD(H)含量試劑盒說明書
 

　　正式測定務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定。

　　測定意義

　　輔酶ⅠNAD(H)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中，NAD+是糖酵解(EMP)和三羧酸循環(huán)(TCA)的主要氫受體，生成的NADH經(jīng)呼吸電子鏈(ETC)傳遞把電子交給氧，在合成ATP的同時，形成大量的ROS，同時NADH再生為NAD+。糖、脂、蛋白質(zhì)三大代謝物質(zhì)分解中的氧化反應(yīng)絕大部分通過這一體系完成。NAD(H)含量和NADH/NAD+比值的高低可用于評價糖酵解和TCA循環(huán)的強弱。較高的NAD(H)及NADH/NAD+比值說明細胞呼吸耗氧量較高，處于過氧化狀態(tài)。此外，NADH/NAD+比值升高也可抑制糖酵解和TCA循環(huán)。另外，NAD+降解產(chǎn)物對細胞信號傳導(dǎo)、代謝和基因表達等具有重要的調(diào)控作用。

　　測定原理

　　分別用酸性和堿性提取液提取樣品中NAD+和NADH，NADH通過PMS的遞氫作用，還原氧化型噻唑藍(MTT)為甲瓚，在570nm下檢測吸光值;而NAD+可被乙醇脫氫酶還原為NADH，進一步采用MTT還原法檢測。

　　需自備的儀器和用品

　　酶標儀、臺式離心機、移液器、96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

　　試劑的組成和配制

　　酸性提取液：液體50mL×1瓶，4℃保存;

　　堿性提取液：液體50mL×1瓶，4℃保存;

　　試劑一：液體10 mL×1瓶，4℃保存;

　　試劑二：液體3 mL×1瓶，4℃保存;

　　試劑三：粉劑×1瓶，-20 ℃保存，用時加入3mL蒸餾水，混勻，用不完的試劑4℃保存一周;

　　試劑四：粉劑×1瓶，4 ℃保存，用時加入3mL蒸餾水，混勻，用不完的試劑4℃保存一周;

　　試劑五：液體3.6mL×1瓶，4 ℃保存;

　　試劑六：液體30mL×1瓶，4 ℃保存;

　　試劑七：液體50mL×1瓶，4 ℃保存。

　　NAD+和NADH的提取

　　1 血清(漿)中NAD+和NADH的提取

　　NAD+的提�。喊凑昭�清(漿)體積(mL)：酸性提取液體積(mL)為1：5~10的比例(建議取約0.1mL血清(漿)，加入1mL酸性提取液)，95℃水浴5min(蓋緊，以防止水分散失);冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心10min;取500μL上清液，加入500μL堿性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測。

　　NADH的提取：按照血清(漿)體積(mL)：堿性提取液體積(mL)為1：5~10的比例(建議取約0.1mL血清(漿)，加入1mL堿性提取液)，95℃水浴5min(蓋緊，以防止水分散失);冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心10min;取500μL上清液，加入500μL酸性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測。

　　2組織中NAD+和NADH的提�。�

　　NAD+的提取：按照組織質(zhì)量(g)：酸性提取液體積(mL)為1：5~10的比例(建議取約0.1g組織，加入1mL酸性提取液)，冰浴研磨，95℃水浴5min(蓋緊，以防止水分散失);冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心10min;取500μL上清液，加入500μL堿性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測。

　　NADH的提�。喊凑战M織質(zhì)量(g)：堿性提取液體積(mL)為1：5~10的比例(建議取約0.1g組織，加入1mL堿性提取液)，冰浴研磨，95℃水浴5min(蓋緊，以防止水分散失);冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心10min;取500μL上清液，加入500μL酸性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測。

　　3 細胞或細菌中NAD+和NADH的提�。�

　　NAD+的提取：先收集細胞或細菌到離心管內(nèi)，棄上清，按照細菌或細胞數(shù)量(104個)：酸性提取液體積(mL)為500~1000：1的比例(建議500萬細菌或細胞加入1mL酸性提取液)，超聲波破碎(冰浴，功率20%或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次)，95℃水浴5min(蓋緊，以防止水分散失);冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心10min;取500μL上清液，加入500μL堿性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測。

　　NADH的提�。合仁占�細胞或細菌到離心管內(nèi)，棄上清，按照細菌或細胞數(shù)量(104個)：堿性提取液體積(mL)為500~1000：1的比例(建議500萬細菌或細胞加入1mL堿性提取液)，超聲波破碎(冰浴，功率20%或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次)，95℃水浴5min(蓋緊，以防止水分散失);冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心10min;取500μL上清液，加入500μL酸性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測。

　　測定步驟：

　　分光光度計或酶標儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至570nm，蒸餾水調(diào)零。

　　加樣表(在1.5mL棕色EP管中按下表依次加樣)：

　　試劑名稱(μL)對照管測定管

　　樣本2020

　　試劑一8080

　　試劑二3030

　　試劑三3030

　　試劑四3030

　　試劑五3030

　　試劑六200混勻，室溫避光靜置20min

　　試劑六200

　　充分混勻，靜置5min后，20000g，25℃離心5min，棄上清，沉淀中加入：

　　試劑七400400

　　混勻，取200μL轉(zhuǎn)移至微量石英比色皿或96孔板中，570nm下讀取對照吸光值A(chǔ)1和測定管吸光值A(chǔ)2，計算△A=A2-A1。

　　注意事項

　　1、如果一次性測定樣本數(shù)較多，可將試劑一、二、三和四按比例配成混合液。

　　2、對照管和測定管的測定步驟的區(qū)別：對照管加完試劑一、二、三、四和五后必須馬上加試劑六;測定管加完試劑一、二、三、四和五后必須反應(yīng)20min后再加試劑六。

　　3、反應(yīng)過程中注意避光。

　　4、若NAD+測定中△A(A2-A1)≤0.0302，NADH測定中△A(A2-A1)≤0.0222，說明樣本中輔酶含量較低，已低于檢測限，可做如下調(diào)整：(1)將測定管避光靜置時間20min延長到60min;(2)在提取階段增加取樣量，即取0.2g樣本或0.2mL樣本加入1mL提取液。

　　5、由于每一個測定管需要設(shè)一個對照管，本試劑盒100管測48個NAD+或NADH.

　　V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.02mL;V2：加入提取液體積，2mL;V3：加入血清(漿)體積：0.1mL;Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL; W：樣本質(zhì)量，g;500：細胞或細菌總數(shù)，500萬。

　　注意：檢測限為0.1nmol/mL或0.1nmol/g鮮重 或0.001nmol/mg prot


　　標簽：輔酶ⅠNAD(H)含量試劑盒 酶標儀 臺式離心機 移液器 96孔板 血清 離心管 Elisa試劑盒

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