牛組織蛋白酶（Cath）酶聯(lián)免疫分析（ELISA）_技術文章

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牛組織蛋白酶（Cath）酶聯(lián)免疫分析（ELISA）
閱讀次數：15525 發(fā)布時間：2021/8/11 15:30:15

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牛組織蛋白酶（Cath）酶聯(lián)免疫分析（ELISA）酶聯(lián)分析檢測試劑盒
本試劑僅供研究使用目的：本試劑盒用于測定牛血清，血漿,組織及相關液體樣本中組織蛋白酶（Cath）的含量。

實驗原理：

本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中牛組織蛋白酶（Cath）水平。用純化的牛組織蛋白酶（Cath）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入組織蛋白酶（Cath），再與HRP標記的組織蛋白酶（Cath）抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經過洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成終的黃色。顏色的深淺和樣品中的組織蛋白酶（Cath）呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中牛組織蛋白酶（Cath）濃度。

試劑盒組成：

試劑盒組成	48孔配置	96孔配置	保存
說明書	1份	1份
封板膜	2片（48）	2片（96）
密封袋	1個	1個
酶標包被板	1×48	1×96	2-8℃保存
標準品：450ng/L	0.5ml×1瓶	0.5ml×1瓶	2-8℃保存
標準品稀釋液	1.5ml×1瓶	1.5ml×1瓶	2-8℃保存
酶標試劑	3 ml×1瓶	6 ml×1瓶	2-8℃保存
樣品稀釋液	3 ml×1瓶	6 ml×1瓶	2-8℃保存
顯色劑A液	3 ml×1瓶	6 ml×1瓶	2-8℃保存
顯色劑B液	3 ml×1瓶	6 ml×1瓶	2-8℃保存
終止液	3ml×1瓶	6ml×1瓶	2-8℃保存
濃縮洗滌液	（20ml×20倍）×1瓶	（20ml×30倍）×1瓶	2-8℃保存

樣本處理及要求：

1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應再次離心。

2. 血漿：應根據標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應該再次離心。

3. 尿液：用無菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。

4. 細胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。檢測細胞內的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復凍融，以使細胞破壞并放出細胞內成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。

5. 組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆�。標本融化后仍然保�?-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。

6. 標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融.

7. 不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

操作步驟

1. 標準品的稀釋與加樣：在酶標包被板上設標準品孔10孔，在、第二孔中分別加標準品100μl，然后在、第二孔中加標準品稀釋液50μl，混勻；然后從孔、第二孔中各取100μl分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標準品稀釋液50μl，混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉，再各取50μl分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標準品稀釋液50ul，混勻；混勻后從第五、第六孔中各取50μl分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標準品稀釋液50μl，混勻后從第七、第八孔中分別取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標準品稀釋液50μl，混勻后從第九第十孔中各取50μl棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為50μl，濃度分別為300ng/L，200ng/L ，100ng/L，50ng/L， 25ng/L）。

2. 加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。

3. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。

4. 配液：將30（48T的20倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水30（48T的20倍）倍稀釋后備用。

5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30后棄去，如此重復5次，拍干。

6. 加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。

7. 溫育：操作同3。

8. 洗滌：操作同5。

9. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.

10. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。

11. 測定：以空白空調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。測定應在加終止液后15分鐘以內進行。

注意事項：

1．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。