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　　PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常出現(xiàn)的問題及解決辦法

　　在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，京城會(huì)遇到一些問題，需要改變各種影響PCR擴(kuò)增的參數(shù)及條件，以改善反應(yīng)產(chǎn)物的常量和特異性。

　　1、沒有得到所希望的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

　�、俅_定是加入酶，檢查酶是否具有活性。

　�、贒NA分子解鏈?zhǔn)欠癯浞帧?/p>

　�、奂尤氲娜斯ず铣梢�物是否爭取。

　　④在未加入Taq DNA聚合酶之，將反映系統(tǒng)放置在95℃保溫5-10分鐘，以使蛋白酶及核酸酶失去活性。

　　2、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在凝膠電泳中呈片狀。

　　①減少Taq DNA聚合酶的濃度。

　�、谠黾油嘶鸬臏囟�

　　③降低Mg++的濃度。

　�、軠p少擴(kuò)增循環(huán)周期次數(shù)。

　�、轀p少退火及延伸的時(shí)間。

　�、迯哪�膠中回收與所希望的段大小相同的DNA,再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

　　3、凝膠電泳中出現(xiàn)引物二聚體區(qū)帶

　�、贆z查引物的3`-端是否互補(bǔ)。

　�、谠O(shè)計(jì)較長的引物。

　�、墼黾影心繕�(biāo)DNA的量。

　�、芙档鸵�物的濃度。

　　⑤減少擴(kuò)增循環(huán)周期次。

　�、拊黾油嘶鸬臏囟�

　　4、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物特異性不夠

　�、僭黾油嘶鸬臏囟�。

　　②減少退火及延伸時(shí)間。

　　③降低引物和Taq DNA聚合酶的濃度。

　　④改變Mg++的濃度

　　預(yù)防PCR擴(kuò)增中污染的措施：

　　1、擴(kuò)增所用的試驗(yàn)要少量分裝保存，為一次實(shí)驗(yàn)的使用。

　　2、實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)人員要穿工作服、戴手套，尤其是RT-PCR擴(kuò)增的過程中必須戴手套。

　　3、實(shí)驗(yàn)中加取標(biāo)本和反應(yīng)試劑要迅速、準(zhǔn)確、盡量減少標(biāo)本取樣的次數(shù)，并就近操作，避免遠(yuǎn)距離一樣，陽性對照加入。

　　4、PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)中所使用的要用，不可竄用。

　　5、實(shí)驗(yàn)中使用的加樣頭，標(biāo)本處理和擴(kuò)增用的離心管要高壓滅菌消毒。

　　6、加權(quán)樣本和擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，不要反復(fù)抽吸和空吸，避免產(chǎn)生氣溶膠，污染實(shí)驗(yàn)室。

　　7、要嚴(yán)格執(zhí)行先加入反映實(shí)際，后加入標(biāo)本DNA。

　　8、擴(kuò)增過程中的流程要有次序，避免已經(jīng)入下步驟的擴(kuò)增標(biāo)本，返回到一步驟，造成污染。

　　PCR擴(kuò)增過程中污染的主要來源

　　核算擴(kuò)增是一項(xiàng)很有效的技術(shù)，但同時(shí)優(yōu)勢很靈敏的方法以至于很容易出現(xiàn)假陽性的反應(yīng)，這種假陽性反應(yīng)的干擾主要產(chǎn)生于3個(gè)方面

　　1、應(yīng)用DNA質(zhì)粒作為核算擴(kuò)增反應(yīng)的陽性對照。

　　2、DNA由林勇標(biāo)本，培養(yǎng)物或由被污染的試劑延續(xù)下來。

　　3、擴(kuò)增DNA的污染(即PCR產(chǎn)物)。

　　PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染的主要排出方法：

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原創(chuàng)作者：本生（天津）健康科技有限公司