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　　核酸電泳的步驟及實驗方法介紹
 

　　核酸電泳是進行核算研究的重要手段，常用于瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠兩種，凝膠電泳操作簡單，是分離鑒定和純化核算的一種常用方法，那么核酸電泳的步驟有哪些的呢?

　　瓊脂糖凝膠電泳的步驟：

　　用透明膠將玻璃板或電泳裝置所配備的塑料盤的邊緣圈封，制成膠模，置水平工作臺上;

　　(2) 稱取適量瓊脂糖，置電泳緩沖液中，加熱使瓊脂糖溶解;

　　(3) 待溶液冷至60℃，加入10mg/ml EB貯存液，使終濃度達0.5mg/ml;

　　(4) 在距離膠模底板0.5-1mm處放置電泳梳，將瓊脂糖溶液倒入膠模中，厚度約3-5mm，注意避免產(chǎn)生氣泡;

　　(5) 凝膠凝固后，移去梳子和透明膠，將凝膠放入電泳槽。加入TBE緩沖液使恰好沒過膠面約1mm;

　　(6) 將DNA樣品與1/6體積加樣緩沖液混合后，加入樣品槽中;

　　(7) 接通電源，使樣品槽在負(fù)端，用1-5v/cm的電壓，電泳適當(dāng)時間;

　　(8) 電泳結(jié)束后，可將含EB的凝膠直接放在紫外線檢測儀上觀察，并拍照記錄，也可將不含EB的凝膠在0.5μg/ml的EB溶液中染色30-45分鐘，再如上觀察和拍照，記錄結(jié)果。

　　聚丙烯酰胺凝膠電泳的步驟:

　　(1) 配制試劑

　　① 30%丙烯酰胺：100ml雙蒸水中含29g丙烯酰胺和1g N，N’-亞甲雙丙烯酰胺。

　�、� 5×TBE　每升溶液含54g Tris.HCl，27.5g硼酸和20ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)。

　�、� 10%過硫酸銨：10ml雙蒸水中含1g過硫酸銨。

　　(2) 裝置膠�！�將玻璃板和墊條事先用去污劑刷洗，并經(jīng)自來水和無離子水沖洗干凈，晾干。裝置時，將較大的玻璃板平放在工作臺上，將兩個墊條放在玻璃板兩側(cè)，涂上少量凡士林，并將上層玻璃板置于墊條上，用夾子將玻板連同墊條夾緊，底部用1%瓊脂糖密封。為防止漏膠，除放梳子一邊外，其余三邊應(yīng)用防水膠帶密封。

　　(3) 根據(jù)玻璃板大小及夾層厚薄計算所需凝膠溶液量，按表配制溶液(100ml)。

　　濃度 3.5 5.0 8.0 12.0 20.0

　　30%丙烯酰胺(ml) 11.6 16.6 26.6 40.6 66.6

　　水(ml) 67.7 62.7 52.7 39.3 12.7

　　5×TBE(ml) 20.0 20.0 20.0 20.0 20.0

　　10%過硫酸銨(ml) 0.7 0.7 0.7 0.7 0.7

　　將35μl TEMED加入100ml混合液中，混勻，然后均勻連續(xù)注入兩玻璃板空隙中。

　　(4) 立即插入電泳梳，勿使梳齒下形成氣泡。

　　(5) 室溫聚合1小時，梳齒下出現(xiàn)折光帶時，表明聚合反應(yīng)已經(jīng)完成。若凝膠不立即使用，可用紗布或濾紙(用1×TBE浸泡)包蓋于凝膠頂部，置4℃保存1-2天。

　　(6) 拔去梳子，立即用水沖洗加樣孔。

　　(7) 除去底部膠帶，將凝膠直立放入電泳槽。在上下兩槽中灌好1×TBE溶液，驅(qū)盡凝膠底部附著的氣泡。并用1×TBE溶液沖洗加樣孔;

　　(8) 將核酸樣品與適量6×凝膠加樣緩沖液(見表2-28)混合，并加入凝膠加樣孔中;

　　(9) 接通電源，正與下槽連接。電壓一般控制在1.8v/cm。電壓過高時凝膠產(chǎn)生的熱量可造成DNA區(qū)帶彎曲，甚至引起小DNA段的解鏈;

　　(10) 電泳畢，取下玻板和凝膠，放在工作臺上，從夾層一角輕撬，將上面的玻板輕輕移開，并小心揭下凝膠，置染色液中染色并進行結(jié)果觀察。

　　注：以上資料僅供參考!

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原創(chuàng)作者：本生（天津）健康科技有限公司