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　　ELISA實驗——試劑盒各步驟操作要點

　　ELISA各個操作步驟的注意要點，珠式、管式及磁性球ELSIA，國外試劑均與特殊儀器配合應(yīng)用，兩者均有詳細的使用說明，嚴格遵照規(guī)定操作，必能得出準確的結(jié)果。

　　1 標本的采取和保存

　　可用作 ELISA測定的標本十分廣泛，體液(如血清)、分泌物等均可作標本以測定其中某種抗體或抗原成份。有些標本可直接進行測定(如血清、尿液)，有些則需經(jīng)預(yù)處理(如糞便和某些分泌物)。大部分ELISA檢測均以血清為標本。血漿中除尚含有纖維蛋白原和抗凝劑外，其他成份均同等于血清。制備血漿標本需借助于抗凝劑，而血清標本只要待血清自然凝固、血塊收縮后即可取得。除特殊情況外，在醫(yī)學檢驗中均以血清作為檢測標本。

　　在ELISA中血漿和血清可同等應(yīng)用。血清標本可按常規(guī)方法采集，應(yīng)注意避免溶血，紅細胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質(zhì)，以HRP為標記的ELISA測定中，溶血標本可能會增加非特異性顯色。血清標本宜在新鮮時檢測。如有細菌污染，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP，也會產(chǎn)生假陽性反應(yīng)。如在冰箱中保存過久，其中的可發(fā)生聚合，在間接法ELISA中可使本底加深。一般說來，在5天內(nèi)測定的血清標本可放置于4℃，超過一周測定的需低溫冰存。

　　凍結(jié)血清融解后，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應(yīng)充分混勻宜輕緩，避免氣泡，可上下顛倒混和，不要在混勻器上強烈振蕩。混濁或有沉淀的血清標本應(yīng)先離心或過濾，澄清后再檢測。反復凍融會使抗體效價跌落，所以測抗體的血清標本如需保存作多次檢測，宜少量分裝冰存。保存血清自采集時就應(yīng)注意無菌操作，也可加入適當防腐劑。
 

　　2 試劑的準備

　　按試劑盒說明書的要求準備實驗中需用的試劑。ELISA中用的蒸餾水或去離子水，包括用于洗滌的，應(yīng)為新鮮的和高質(zhì)量的。自配的緩沖液應(yīng)用pH計測量較正。從冰箱中取出的試驗用試劑應(yīng)待溫度與室溫平衡后使用。試劑盒中本次試驗不需用的部分應(yīng)及時放回冰箱保存。

　　3 加樣

　　在 ELISA中一般有3次加樣步聚，即加標本，加酶結(jié)合物，加底物。加樣時應(yīng)將所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。

　　加標本一般用微量加樣器，按規(guī)定的量加入板孔中。

　　每次加標本應(yīng)更換吸嘴，以免發(fā)生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加樣。有此測定(如間接法 ELISA)需用稀釋的血清，可在試管中按規(guī)定的稀釋度稀釋后再加樣。也可在板孔中加入稀釋液，再在其中加入血清標本，然后在微型震蕩器上震蕩1分鐘以混和。加酶結(jié)合物應(yīng)用液和底物應(yīng)用液時可用定量多道加液器，使加液過程迅速完成。

　　4 保溫

　　在 ELISA中一般有兩次抗原抗體反應(yīng)，即加標本和加酶結(jié)合物后�？乖�抗體反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時間，這一保溫過程稱為溫育(incubation)，有人稱之為孵育，在ELISA中似不恰當。

　　ELISA屬固相免疫測定，抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。以抗體包被的夾心法為例，加入板孔中的標本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結(jié)合的機會，只有貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個逐步平衡的過程，因此需經(jīng)擴散才能達到反應(yīng)的終點。在其后加入的酶標記抗體與固相抗原的結(jié)合也同樣如此。這就是為什么ELISA反應(yīng)總是需要一定時間的溫育。

　　溫育常采用的溫度有 43℃、37℃、室溫和4℃(冰箱溫度)等。37℃是實驗室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度。在建立ELI SA方法作反應(yīng)動力學研究時，實驗表明，兩次抗原抗體反應(yīng)一般在37℃經(jīng)1-2小時，產(chǎn)物的生成可達頂峰。為加速反應(yīng)，可提高反應(yīng)的溫度，有些試驗在43℃進行，但不宜采用更高的溫度。抗原抗體反應(yīng)4℃更為，在放射免疫測定中多使反應(yīng)在冰箱中過夜，以形成多的沉淀。但因所需時間太長，在ELISA中一般不予采用。

　　保溫的方式除有的 ELISA儀器附有特制的電熱塊外，一般均采用水浴，可將ELISA板置于水浴箱中，ELISA板底應(yīng)貼著水面，使溫度迅速平衡。為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，此時可讓反應(yīng)板漂浮在水面上。

　　若用保溫箱，ELISA板應(yīng)放在濕盒內(nèi)，濕盒要選用傳熱性良好的材料如金屬等，在盒底墊濕的紗布，將ELISA板放在濕紗布上。濕盒應(yīng)先放在保溫箱中預(yù)溫至規(guī)定的溫度，特別是在氣溫較低的時候更應(yīng)如此。無論是水浴還是濕盒溫育，反應(yīng)板均不宜疊放，以各板的溫度都能迅速平衡。

　　室溫溫育的反應(yīng)，操作時的室溫應(yīng)嚴格限制在規(guī)定的范圍內(nèi)，標準室溫溫度是指20-25℃，但具體操作時可根據(jù)說明書的要求控制溫育。室溫溫育時，ELISA板只要平置于操作臺上即可。應(yīng)注意溫育的溫度和時間應(yīng)按規(guī)定力求準確。為這一點，一個人操作時，一次不宜多于兩塊板同時測定。

　　5 洗滌

　　洗滌在 ELISA過程中雖不是一個反應(yīng)步驟，但卻也決定著實驗的成敗。ELSIA就是靠洗滌來達到分離游離的和結(jié)合的酶標記物的目的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，以及在反應(yīng)過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。

　　聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來。可以說在ELISA操作中，洗滌是主要的關(guān)鍵技術(shù)，應(yīng)引起操作者的高度重視，操作者應(yīng)嚴格按要求洗滌，不得馬虎。

　　洗滌的方式除某些ELISA儀器配有特殊的自動洗滌儀外，手工操作有浸泡式和流水沖洗式兩種�！　�6 顯色和比色

　　6.1 顯色

　　顯色是 ELISA中的一步溫育反應(yīng)，此時酶催化無色的底物生成有色的產(chǎn)物。反應(yīng)的溫度和時間仍是影響顯色的因素。在一定時間內(nèi)，陰性孔可保持無色，而陽性孔則隨時間的延長而呈色加強。適當提高溫度有助于加速顯色進行。

　　6.2 比色

　　比色應(yīng)先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標比色儀的比色架中。以軟板為載體的試驗，需先將板置于標準96孔的座架中，才可進行比色。在加底物液顯色，先將軟板邊緣剪凈，這樣，此板就可平妥坐入座架中。

　　比色時應(yīng)先以蒸餾水校零點，測讀底物孔(未經(jīng)任何反應(yīng)僅加底物液的孔)和空白孔(以生理鹽水或稀釋液代替標本作全過程的孔)，以記錄本次試驗的試劑狀況。其后可用空白孔以蒸餾水校零點，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然后進行計算。

　　比色結(jié)果的表達以往通用光密度(oplical density，OD)，現(xiàn)按規(guī)定用吸光度(absorbence，A)，兩者含義相同。通常的表示方法是，將吸收波長寫于A字母的右下角，如OPD的吸收波長為492nm，表示方法為"A492nm"或"OD492nm"。

　　6.3 酶標比色儀

　　酶標比色儀簡稱酶標儀，通常指用于測讀 ELISA結(jié)果吸光度的光度計。針對固相載體形式的不同，各有特制的適用于板、珠和小試管的設(shè)計。許多試劑公司配套供應(yīng)酶標儀。酶標儀的主要性能指標有：測讀速度、讀數(shù)的準確性、重復性、度和可測范圍、線性等等。

　　優(yōu)良的酶標儀的讀數(shù)一般可到0.0 01，準確性為±1%，重復性達0.5%。舉例說，若某孔測得的A值為1.083，則該孔相對于空氣的真實A值應(yīng)為1.083± 0.01(1.073~1.093)，重復測定數(shù)次，其A值均應(yīng)1.083±0.05(1.078~1.088)在之間。酶標儀的可測范圍視各酶標儀的性能而不同。

　　普通的酶標儀在0.000~2.000，新型號的酶標儀上限拓寬達2.900，甚至更高。

　　各種酶標儀性能有所不同，使用中應(yīng)詳細閱讀說明書。

　　7 結(jié)果判斷

　　7.1 定性測定

　　定性測定的結(jié)果判斷是對受檢標本中是否含有待測抗原或抗體作出 "有"或"無"的簡單回答，分別用"陽性"、"陰性"表示。"陽性"表示該標本在該測定系統(tǒng)中有反應(yīng)。"陰性"則為無反應(yīng)。用定性判斷法也可得到半定量結(jié)果，即用滴度來表示反應(yīng)的強度，其實質(zhì)仍是一個定性試驗。

　　在這種半定量測定中，將標本作一系列稀釋后進行試驗，呈陽性反應(yīng)的稀釋度即為滴度。根據(jù)滴度的高低，可以判斷標本反應(yīng)性的強弱，這比觀察不稀釋標本呈色的深淺判斷為強陽性、弱陽性更具定量意義。

　　在間接法和夾心法 ELSIA中，陽性孔呈色深于陰性孔。在競爭法ELISA中則相反，陰性孔呈色深于陽性孔。兩類反應(yīng)的結(jié)果判斷方法不同，分述于下。

　　(1)間接法和夾心法

　　這類反應(yīng)的定性結(jié)果可以用肉眼判斷。目視標本也無色或近于無色者判為陰性，顯色清晰者為陽性。但在 ELSIA中，正常人血清反應(yīng)后常可出現(xiàn)呈色的本底，此本底的深淺因試劑的組成和實驗的條件不同而異，因此實驗中必須加測陰性對照。陰性對照的組成應(yīng)為不含受檢物的正常血清或類似物。在用肉眼判斷結(jié)果時，更宜用顯色深于陰性對照作為標本陽性的指標。

　　目視法簡捷明了，但頗具主觀性。在條件許可下，應(yīng)該用比色計測定吸光值，這樣可以得到客觀的數(shù)據(jù)。先讀出標本(sample，S)、陽性對照(P)、和陰性對照(N)的吸光值，然后進行計算。計算方法有多種，大致可分為陽性判定值法和標本與陰性對照比值法兩類。

　　a.陽性判定值

　　陽性判定值(cut-off value)一般為陰性對照A值加上一個特定的常數(shù)，以此作為判斷結(jié)果陽性或陰性的標準。

　　用此法判斷結(jié)果要求實驗條件十分恒定，試劑的制備必須標準化，陽性和陰性的對照品應(yīng)符合一定的規(guī)格，須配用精密的儀器，并嚴格按規(guī)定操作。陽性判定值公式中的常數(shù)是在這特定的系統(tǒng)中通過對大量標本的實驗檢測而得到的。

　　現(xiàn)舉某種檢測 HBsAg的試劑盒為例。試劑盒中的陰性對照品為不含HBsAg的復鈣人血漿，陽性對照品HBsAg的含量標明為P=9±2ng /ml。每次試驗設(shè)2個陽性對照和3個陰性對照。測得A值后，先計算陰性對照A值的平均數(shù)(NC X )和陽性對照A值的平均數(shù)(PCX)，兩個平均數(shù)的差(P-N)必須大于一個特定的數(shù)值(例0.400)，試驗才有效。

　　3個陰性對照A值均應(yīng)≥0.5×NCX，并≤1.5×NCX，如其中超出此范圍，則棄去，而已另兩個陰性對照重新計算NCX;如有兩個陰性對照A值超出以上范圍，則該次實驗無效。陽性判定值按下式計算：

　　陽性判定值=NCX+0.05

　　標本 A值>陽性判定值的為陽性，小于陽性判定值的為陰性。應(yīng)注意的是，式中0.05為該試劑盒的常數(shù)，只適合于該特定條件下，而不是對各種試劑均可通用。

　　根據(jù)以上敘述可以看出，在這種方法中陰性對照和陽性對照也起到試驗的質(zhì)控作用，試劑變質(zhì)和操作不當均會產(chǎn)生"試驗無效"的后果。

　　b.標本/陰性對照比值

　　在實驗條件(包括試劑)較難恒定的情況下，這種判斷法較為合適。在得出標本( S)和陰性對照(N)的A值后，計算S/N值。也有寫作P/N的，這里的P不代表陽性(positive)，而是病人(pati ent)的縮寫，不應(yīng)誤解。

　　為避免混淆，更宜用S/N表示。在早期的間接法ELISA中，有些作者定出S/N為陽性標準，現(xiàn)多為各種測定所沿用。實際上每一測定系統(tǒng)應(yīng)該用實驗求出各自的S/N的閾值。更應(yīng)注意的是，N所代表的陰性對照是不含受檢物質(zhì)的人血清。

　　有的試劑盒中所設(shè)陰性對照為不含蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)含量較底的緩沖液，以致反應(yīng)后產(chǎn)生的本底可能較正常人血清的本底低得多。因此，這類試劑盒規(guī)，如N<0.05<>(或其他數(shù)值)，則按0.05計算，否則將出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

　　(2)競爭法

　　在競爭法 ELISA中，陰性孔呈色深于陽性孔。陰性呈色的強度取決于反應(yīng)中酶結(jié)合物的濃度和加入競爭抑制物的量，一般調(diào)節(jié)陰性對照的吸光度在1.0-1.5之間，此時反應(yīng)為敏感。

　　競爭法 ELISA不易用自視判斷結(jié)果，因肉眼很難辨別弱陽性反應(yīng)與陰性對照的顯色差異，一般均用比色計測定，讀出S、P和N的吸光值。計算方法主要也有兩種，即陽性判定值法和抑制率法。

　　a. 陽性判定值法

　　與間接法和夾心法中的陽性判定值法基本相同，但在計算公式中引入陽性對照 A值，現(xiàn)舉某種檢測抗HBc的試劑盒為例。試劑盒中的陰性對照為不含抗HBc的復鈣人血漿，陽性對照中抗HBc含量為125±1 00u/ml。每次試驗設(shè)2個陽性對照和3個陰性對照。

　　測得A值后，先計算陰性對照A值的平均值(NC X )和陽性對照A值的平均數(shù)(PCX)，兩個平均數(shù)的差(N-P)必須大于一個特定的數(shù)值(例如0.300),試驗才有效。

　　3個陰性對照A值均應(yīng)小于2.000，而且應(yīng)≥0.5×NCX并≤1.5×NCX，如其中超出此范圍，則棄去，而以另2個陰性對照重新計算×NCX;如有2個陰性對照A超出以上范圍，則該次實驗無效。陽性判定值按下式計算：

　　陰性判定值=0.4×NCX+0.6×PCX

　　標本A值≤陽性判定值的反應(yīng)為陽性，A>陽性判定值的反應(yīng)為陰性。

　　b. 抑制率法

　　抑制率表示標本在競爭結(jié)合中標本對陰性反應(yīng)顯色的抑制程度，按下式計算：

　　抑制率(%)= (陰性對照A值-標本A值)×100%/陰性對照A值

　　一般規(guī)定抑制率≥50%為陽性，<50%為陰性。

　　7.2 定量測定

　　ELSIA操作步驟復雜，影響反應(yīng)因素較多，特別是固相載體的包被難達到各個體之間的一致，因此在定量測定中，每批測試均須用一系列不同濃度的參考標準品在相同的條件下制作標準曲線。

　　測定大分子量物質(zhì)的夾心法ELISA，標準曲線的范圍一般較寬，曲線點的吸光度可接近2.0，繪制時常用半對數(shù)紙，以檢測物的濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標，將各濃度的值逐點連接，所得曲線一般呈S形，其頭、尾部曲線趨于平坦，中央較呈直線的部分是理想的檢測區(qū)域。

　　測定小分子量物質(zhì)常用競爭法，其標準曲線中吸光度與受檢物質(zhì)的濃度呈負相關(guān)。標準曲線的形狀因試劑盒所用模式的差別而略有不同。

　　注：以上資料僅供參考!

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