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“elisa試劑盒"常見的問題及解答 2024已更新(每日/實時)
閱讀次數(shù):15292 發(fā)布時間:2024/2/4 9:06:53
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  “elisa試劑盒"常見的問題及解答

 

  問:抗原檢測出的分子量比資料上的大,是怎么回事?

  答:a)抗原形成了二聚體。增多巰基乙醇量,煮沸變性時間延長,可以打開二聚體。b)蛋白本身的修飾如:糖基化,磷酸化等。

  問:蛋白轉(zhuǎn)移不到膜上,但膠上有,同時Marker 轉(zhuǎn)上去了,為什么?

  答:可能是:a)樣品濃度過低;b)轉(zhuǎn)移時間不夠。

  問:磷酸化抗體的檢測樣本制備時是否一定要加NaF等?

  答:NaF是一種廣譜磷酸化酶的抑制劑,一般加。但是不加也可以,大部分時候是不用加的。

  問:要驗證某個細(xì)胞上有無該蛋白的存在,需要做免疫組化和western blot試驗嗎?做這兩個試驗時的一抗和二抗可以共用嗎?

  答:①免疫組化可以用來進(jìn)行定位,但是不能定量,而且有時會有假陽性,不易與背景區(qū)分;Western blot可以特異性檢測某個蛋白質(zhì)分子,進(jìn)行定量,但是不能定位。

  ②兩種實驗的一抗有時候不能通用,公司的產(chǎn)品說明一般都會說明可以進(jìn)行什么實驗,在免疫組化時,是否適合石蠟切片或者冰凍切片。

  問:做Western Blot時,提取蛋白后凍存(未加蛋白酶抑制劑),用的博士德的一抗,開始還有點痕跡,現(xiàn)在越來越差,上樣量已加到120μg,換了個santa cloz的一抗仍不行。是什么原因?蛋白酶抑制劑單加PMSF行嗎?

  答:懷疑是樣品問題,可能是:1,樣品不能反復(fù)凍融;2,樣品未加蛋白酶抑制劑。同時,建議檢查Western Blot過程,提高一抗?jié)舛取τ诩拥鞍酌敢种苿﹣碚f,一般加PMSF就可以了,能多加幾中種蛋白酶抑制劑。

  問:細(xì)胞水平要做western blot,多少細(xì)胞提的蛋白夠做western blot?

  答:一般5×10^6就足夠了

  問:同一樣品能同時提RNA又提蛋白么?這樣對western blot有無影響?

  答:能,沒有問題。

  問:同一蛋白樣品能同時進(jìn)行兩種因子的Western Blot檢測嗎?

  答:當(dāng)然可以,有的甚至可以同時測幾十種樣品。

  問:如果目標(biāo)蛋白是膜蛋白或是胞漿蛋白,操作需要注意什么?

  答:如果是膜蛋白和胞漿蛋白,所用的去垢劑要溫和得多,這時加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。

  問:我的樣品的蛋白含量很低,每微升不到1微克,但是在轉(zhuǎn)膜時經(jīng)常會發(fā)現(xiàn)只有一部分蛋白轉(zhuǎn)到了膜上,就是在轉(zhuǎn)膜后染膠發(fā)現(xiàn)有的孔所有的蛋白條帶都在,只是顏色變淡了,有什么辦法可以解決?

  答:你可以加大上樣量,沒有問題,還有轉(zhuǎn)移時你可以用減少電流延長時間,加20%甲醇。

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