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　　實驗分享 | 免疫組織化學(xué)技術(shù)(原理、材料與儀器、步驟)

　　原理

　　帶顯色劑標記的特異性抗體在組織細胞原位通過抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng)，對相應(yīng)抗原進行定性、定位、定量測定的一項新技術(shù)。它把免疫反應(yīng)的特異性、組織化學(xué)的可見性巧妙地結(jié)合起來，借助顯微鏡(包括熒光顯微鏡、電子顯微鏡)的顯像和放大作用，在細胞、亞細胞水平檢測各種抗原物質(zhì)(如蛋白質(zhì)、多肽、酶、激素、病原體以及受體等)。

　　材料與儀器

　　切片

　　細胞通透液 乙醇 蒸餾水 雙氧y水 Triton X-100 羊血清 DAB Xylene 蘇木j染液 雙蒸水 中性樹膠

　　微波爐 吹風機 組化筆 濕盒 烤箱 振蕩器 染缸 光學(xué)顯微鏡 純木漿衛(wèi)生紙 計時器 通風櫥

　　步驟

　　一. 試劑配制

　　1. 0.01 M PBS(pH 7.34 )

　　9.0 g NaCl + 50 ml 0.2 M PB加雙蒸水至1000 ml;1000 ml 0.2 M PB (pH 7.4)=5.93 g NaH2PO4·2H2O+58.02 g Na2HPO4·12H2O in 1000 ml雙蒸水或=190 ml A + 810 ml B(A. 0.2 M NaH2PO4·2H2O：15.6 g in 500 ml ddH2O;B. 0.2 M Na2HPO4·12H2O：71.632 g in 1000 ml dH2O)。

　　2. Citrate Buffered Saline(0.01 M檸檬酸緩沖液，pH6.0)

　　28 ml A + 72 ml B + 200 ml ddH2O(A.Citrate acid(檸檬酸)：10.5 g 加雙蒸水至1000 ml;B.Citrate sodium(檸檬酸鈉)：29.41 g加雙蒸水至1000 ml)。

　　3. 細胞通透液

　　由終濃度分別為0.3%雙y水和0.3%Triton X-100混合而成。配制方法是先用微波加熱的36 ml PBS，再接著加120 ul TritonX-100，并加熱一會兒，冷卻至臨用加0.4 ml 30%H2O2。

　　4. 5%羊血清或封閉血清，用PBS稀釋。

　　5. 含0.03%H2O2的0.05%DAB(避光)：用20×DAB(1%，10 mg/ml)5 ul+0.1 ul 30% H2O2+95 ul PBS。

　　6. 一抗、二抗均用PBS稀釋。

　　7. Xylene、梯度Ethanol(100%x2、95%、80%、70%、50%)、雙蒸水、中性樹膠(封裱劑)。

　　8. 蘇木j染液

　　二. 操作步驟

　　1. 脫蠟、水化

　　(1)60 ℃x20 min→Xylene 2 x10 minutes;

　　(2)100% absolute ethanol：2 x5 minutes;

　　(3)95% ethanol 2 minutes;

　　(4)80% ethanol 2 minutes;

　　(5)70% ethanol 2 minutes;

　　(6) distilled water：5 min;

　　(7)PBS洗3次x3 min。

　　2、細胞通透、封閉內(nèi)源性過氧化物酶

　　(1)用封閉通透液浸潤切片30 min(RT避光)。配法是用預(yù)熱40 ml PBS加120 ul TritonX-100加熱幾分鐘后，臨用加400 ul 30%H2O2。

　　(2) PBS溶液洗3次x3 min。

　　3、抗原修復(fù)暴露抗原決定族

　　(1) 切片放入0.01 M檸檬酸鈉緩沖溶液(pH6.0)后，在微波爐里高火4 min至沸騰后，再加熱約6 minx4次，每次間隔補足液體，防止干片。

　　4、封閉非特異性蛋白

　　(1) PBS溶液洗3次x3 min;

　　(2)將切片取出，周圍水分用濾紙吸干,用組化筆在組織周圍畫上圈,在圓圈內(nèi)組織滴入5%羊血清(與二抗來源一致)后放入濕盒中,室溫30(10～30)min;

　　5、一抗孵育

　　(1) 甩去切片上的羊血清,用濾紙擦干組織周圍殘留血清，直接加入已稀釋的一抗(1：250、500、1000)后，放入濕盒中室溫1小時，然后4度過夜，從冰箱中取出需37 ℃復(fù)溫45 min。

　　6、二抗孵育

　　(1)將一抗倒掉并用PBS洗5 minx5次;

　　(2) 用濾紙將圓圈周圍的水吸去，加入已稀釋的二抗后放入37 ℃恒溫烤箱中30 min(回收)。

　　(3)用PBS洗5次x5 min;

　　7、SP反應(yīng)

　　(1) 加入SP后放入37度烤箱中30 min。

　　(2) 用PBS洗5次x5 min;

　　8、顯色

　　(1)加入DAB(快速滴入，觀察染色情況，倒掉染液)，顯色時間控制在約5 min(3～10 min)，由鏡下觀察顏色控制時間。

　　0.05%DAB(避光)(1：20儲備液)：5 ul 20xDAB+0.1 ul 30% H2O2+95 ul PBS。1%DAB儲備液的配制：50 mg DAB+5 ml 0.05 mol/L PBS充分溶解，-20 ℃保存。

　　9、復(fù)染、脫水、透明、封片

　　(1)用PBS 3次x3min后，用雙蒸水洗5 min;

　　(2)加一大滴蘇木素染液，胞核蛋白染幾，胞漿或胞膜蛋白染20 s后自來水沖洗，雙蒸水洗5 min，再用PBS返藍5 min。

　　(3)脫水

　　(4)透明

　　Xylene 1x(1-2) min→Xylene 2x(1-2) min

　　(5) 封片

　　中性樹膠。

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