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　　人組織蛋白酶D(cath-D)ELISA試劑盒方法描述

　　人組織蛋白酶D(cath-D)是一種溶酶體天冬氨酸蛋白酶，具有降解蛋白質(zhì)和激活溶酶體室中生物活性蛋白體的功能。為了準確、靈敏地檢測人組織蛋白酶D的含量，我們采用了雙抗體夾心法的ELISA試劑盒。下面將詳細介紹該試劑盒的方法描述。

　　一、實驗原理 本試劑盒采用雙抗體夾心法測定標本中人組織蛋白酶D(CTSD)水平。先，用純化的人組織蛋白酶D(CTSD)捕獲抗體包被微孔板，制成固相抗體。然后，往包被的微孔中依次加入人組織蛋白酶D(CTSD)，再與HRP標記的檢測抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物。經(jīng)過洗滌后，加入底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人組織蛋白酶D(CTSD)呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(OD值)，通過標準曲線計算樣品中人組織蛋白酶D(CTSD)含量。

　　二、實驗步驟

　　1. 包被：用0.05MPH9.6的碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1～10μg/ml。在每個聚苯乙烯板的反應孔中加0.1ml，4℃過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。

　　2. 加標本：加標本需將標本進行適當稀釋，一般使用微量加樣器按規(guī)定的量加入板孔中。注意每次加標本應更換吸嘴，以免發(fā)生交叉污染。加樣過程中應避免產(chǎn)生氣泡，以免影響實驗結(jié)果。

　　3. 溫育：加入標本后，進行溫育。溫育溫度和時間對實驗結(jié)果有重要影響，一般需在37℃恒溫箱中溫育1小時。

　　4. 加酶結(jié)合物：溫育結(jié)束后，棄去孔內(nèi)液體，用洗滌緩沖液洗3次。然后加入酶結(jié)合物，再次進行溫育。

　　5. 顯色：溫育結(jié)束后，棄去孔內(nèi)液體，用洗滌緩沖液洗3次。然后加入底物TMB，避光顯色。

　　6. 終止：顯色一定時間后，加入終止液終止反應。此時，孔內(nèi)液體顏色由藍色轉(zhuǎn)為黃色。

　　7. 測定：用酶標儀在450nm波長下測定各孔OD值。注意測定需將酶標儀預熱，并使用空白孔調(diào)零。

　　三、結(jié)果計算與分析 根據(jù)測定的OD值，通過標準曲線計算樣品中人組織蛋白酶D(CTSD)含量。標準曲線一般通過繪制不同濃度標準品的OD值繪制而成。通過比較樣品OD值與標準曲線上的OD值，即可計算出樣品中人組織蛋白酶D(CTSD)的含量。

　　四、注意事項

　　1. 實驗中使用的所有試劑和器材應嚴格按照說明書要求進行準備和操作。

　　​注：以上資料僅供參考!

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原創(chuàng)作者：本生（天津）健康科技有限公司