凝膠電泳是一種常用的實驗室技術，可鑒定、定量和純化核酸片段。我們常用的是瓊脂糖凝膠電泳，可以用來分離鑒定和純化DNA段。
將樣品上樣到瓊脂糖膠的孔內(nèi)并放入電場，使帶負電荷的核酸向正移動。蛋白質(zhì)和核酸會根據(jù)pH不同帶有不同電荷，在電場中受力大小不同，因此跑的速度不同，根據(jù)這個原理可將其分開。較短的DNA段遷移較快，而長的片段的遷移為緩慢，從而實現(xiàn)基于DNA段大小的分離。
每當提取完質(zhì)粒之后在鑒定檢測DNA時，制備使用瓊脂糖凝膠的過程中應該要多注意，DNA酶污染的儀器可能會使DNA降解，造成條帶信號弱、模糊甚至缺失的現(xiàn)象。為了得到更好的跑膠圖，我們應該要考慮到以下幾個影響DNA分子遷移率的因素：
①凝膠濃度
對于瓊脂糖凝膠電泳，濃度通常在0.5~2%之間，低濃度的用來進行大片段核酸的電泳，高濃度的用來進行小片段分析，但是低濃度膠易碎，為了避免此現(xiàn)象，我們要小心操作和使用質(zhì)量好的瓊脂糖。注意高濃度的膠可能使分子大小相近的DNA帶不易分辨，造成條帶缺失的現(xiàn)象。
②緩沖液
在沒有離子存在時(如誤用蒸餾水配制凝膠，電導率小，DNA幾乎不移動，在高離子強度的緩沖液中(如誤加10×電泳緩沖液)，則電導很高并明顯產(chǎn)熱，嚴重時會引起凝膠熔化。
常用的緩沖液有TAE和TBE，而TBE比TAE有著更好的緩沖能力。電泳時使用新制的緩沖液可以明顯提高電泳效果。電泳緩沖液多次使用后，離子強度降低，pH值上升，緩沖性能下降，可能會使DNA電泳產(chǎn)生條帶模糊和不規(guī)則的DNA帶遷移的現(xiàn)象。
③電壓和溫度
電泳時電場強度不應該超過20V/cm，電泳溫度應該低于30℃。低電壓時，線狀DNA段遷移速率與所加電壓成正比。但是隨著電場強度的增加，不同分子量DNA段的遷移率將以不同的幅度增長，隨著電壓的增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。若要使大于2kb的DNA段的AA分辨率達到，所加電壓不得超過5v/cm，溫度應該低于15℃。注意如果電泳時電壓和溫度過高，可能導致出現(xiàn)條帶模糊和不規(guī)則的DNA帶遷移的現(xiàn)象。特別是電壓太大可能導致小片段跑出膠而出現(xiàn)缺帶現(xiàn)象。
④DNA樣品的純度和狀態(tài)
注意樣品中含鹽量太高和含雜質(zhì)蛋白均可以產(chǎn)生條帶模糊和條帶缺失的現(xiàn)象。乙醇沉淀可以去除多余的鹽，用酚可以去除蛋白。注意變性的DNA樣品可能導致條帶模糊和缺失，也可能出現(xiàn)不規(guī)則的DNA條帶遷移。在上樣不要對DNA樣品加熱，用20mM NaCl緩沖液稀釋可以防止DNA變性。
⑤DNA的上樣
正確的DNA上樣量是條帶清晰的。DNA上樣量大可能導致DNA帶型模糊對判斷其大小有影響，而太小的DNA上樣量則導致帶信號弱甚至缺失。
⑥Marker的選擇
DNA電泳一定要使用DNA Marker或已知大小的正對照DNA來估計DNA段大小。Marker應該選擇在目標片段大小附近ladder較密的，這樣對目標片段大小的估計才比較準確。需要注意的是Marker的電泳同樣也要符合DNA電泳的操作標準。
⑦凝膠的染色和觀察（針對用EB染色的凝膠）
實驗室常用的核酸染色劑是溴化乙錠(EB)，染色效果好，操作方便，但是穩(wěn)定性差，具有毒性。注意觀察凝膠時應根據(jù)染料不同使用合適的光源和激發(fā)波長，如果激發(fā)波長不對，條帶則不易觀察，出現(xiàn)條帶模糊的現(xiàn)象。
DNA如果降解或者混有其他雜質(zhì)比如蛋白質(zhì)、RNA的話,在電泳中我們是可以檢測到的。線性的單一DNA樣品一般是單條帶，質(zhì)粒的話可能會有2-3條帶，這和DNA分子的構象有關。
如果條帶變寬、變暗、或者變成彌散的DNA條帶,表示DNA非特異的降解，還有一種可能是太久沒有更換電泳緩沖液造成的。
如果有蛋白質(zhì)污染,上樣孔可能發(fā)亮。
如果跑膠時DNA上樣量過多導致條帶寬度大，無法準確判斷其大小。
原創(chuàng)作者：本生（天津）健康科技有限公司
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